在ELISA檢測試劑盒中一般有3次加樣步聚，即加標本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA試劑盒板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。
加標本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。
有此測定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標本，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。在ELISA檢測試劑盒中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標本和加酶結(jié)合物后。抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育（incubation），有人稱之為孵育，在ELISA檢測試劑盒中似不恰當。
ELISA檢測試劑盒屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機會，只有zui貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐，因此需經(jīng)擴散
才能達到反應(yīng)的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA檢測試劑盒反應(yīng)總是需要一定時間的溫育。
溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。在建立ELISA方法作反應(yīng)動力學研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時，產(chǎn)物的生成可達。為加速
反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜采用更高的溫度?？乖贵w反應(yīng)4℃更為*，在放射免疫測定中多使反應(yīng)在冰箱中，以形成zui多的沉淀。但因所需時間太長，在ELISA試劑盒中一般不予采用。
保溫的方式除有的ELISA檢測試劑盒儀器附有特制的電熱塊外，一般均采用水浴，可將ELISA試劑盒板置于水浴箱中，ELISA檢測試劑盒板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA試劑盒板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，zui后將ELISA試劑盒板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預溫至規(guī)定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應(yīng)如此。無論是水浴還是濕盒溫育，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應(yīng)，操作時的室溫應(yīng)嚴格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標準室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫育。室溫溫育時，ELISA檢測試劑盒板只要平置于操作臺上即可。應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準確。為保證這一點，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。
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